近期，國際期刊《Clinical Microbiology and Infection》發(fā)表了基于CRISPR技術的一種高靈敏性和高特異性檢測乙型肝炎病毒（HBV）DNA的新方法,。論文題目是“Highly sensitive and specific detection of HBV DNA and drug resistance mutations utilizing the PCR-based CRISPR-Cas13a system”,。該科研成果由.解放軍疾病預防控制中心宋宏彬研究員科研團隊、軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所周育森研究員科研團隊和首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院任鋒科研團隊共同協(xié)作完成,。

臨床上主要通過HBV核酸（DNA）檢測和免疫學檢測進行HBV感染的診斷和抗病毒療效的監(jiān)測,。目前，國產(chǎn) HBV DNA 檢測大多都存在靈敏度低,、特異性及準確性差,、線性范圍窄等缺陷。尤其是對于低病毒載量的患者,，極易出現(xiàn)假陰性的結果,，嚴重影響臨床的抗病毒治療的啟動、檢測抗病毒療效的觀察,、CHB 特殊人群（輸血,、腫瘤,、隱匿性感染等）病情的判斷等。高靈敏度HBV DNA檢測在OBI（Occult hepatitis B virus infection,，OBI）篩查,、術前檢查、腫瘤患者放,、化療后HBV再激活風險評估,、抗病毒治療療效與終點評價以及預測HBV表面抗原（HBeAg）陰性患者HBV耐藥突變等方面表現(xiàn)出了突出的臨床價值。雖然國外高靈敏度 HBV DNA 檢測下限達到 20IU/mL 甚至更低,，但從各指南可以看出,，國內(nèi)外專家認為，HBV DNA越早控制越好,，HBV DNA水平降的越低越好,。因此更高靈敏度、更高特異性的HBV DNA的方法的建立就顯得尤為重要,。

規(guī)律間隔性成簇短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,，CRISPR）/ CRISPR相關蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）是大多數(shù)細菌及古細菌中抵御病毒入侵的一種獲得性免疫方式,。CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的免疫機理：當病毒首次入侵時,，細菌會將病毒的小片段DNA整合到自身的CRISPR間隔區(qū)；病毒再次入侵時,，CRISPR轉錄生成一條前體CRISPR RNA（pre-crRNA）,，pre-crRNA被RNA內(nèi)切酶切割生成含有與病毒靶標序列匹配的成熟CRISPR RNA（crRNA），該crRNA引導具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白對靶標序列進行識別和降解,。2016年6月,，張峰等報道了Cas13a是一種在crRNA引導下與靶標RNA特定位點結合并切割的核酸內(nèi)切酶，并將Cas13a與重組酶聚合酶等溫擴增技術結合,，開發(fā)了一個兼具高特異性和靈敏性的酶解鎖報告探針（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing,，SHERLOCK）的核酸檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)了單個核酸分子的檢測,。2018年,，張峰等發(fā)現(xiàn)當Cas12a特異性結合和切割目標雙鏈DNA后，具有非特異性切割單鏈DNA（single strand DNA,，ssDNA）的活性,，并利用Cas12a的該附屬切割活性開發(fā)了一個基于DNA內(nèi)切酶靶向CRISPR非特異性的報告探針（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR）的核酸檢測系統(tǒng),。研究進一步證明：基于CRISPR技術可實現(xiàn)快速,、精確、便攜式的核酸診斷,，其有望成為下一代核酸診斷新技術,。

本研究建立了基于CRISPR技術的PCR-CRISPR-HBV DNA檢測新方法并進行了HBV DNA檢測的臨床驗證,。研究表明：PCR-CRISPR-HBV DNA新方法可以檢測1個拷貝的HBV DNA，超過目前現(xiàn)有的熒光定量PCR檢測方法,。利用312例HBV患者血清標本,，302例PCR-CRISPR檢測結果和熒光定量PCR檢測檢測具有一致性，但是10例低拷貝HBV DNA能夠通過PCR-CRISPR方法和數(shù)字PCR方法檢測出來,，而熒光定量PCR檢測不出,。因此基于CRISPR技術的PCR-CRISPR-HBV DNA檢測新方法具有高度的靈敏性和特異性。

本研究還利用PCR-CRISPR-HBV DNA檢測新方法對HBV YMDD核酸變異進行了檢測,。研究表明：利用424例HBV患者血清標本進行YMDD耐藥檢測,，PCR-CRISPR方法、YMDD qPCR和測序方法都檢測出412例耐藥YMDD位點,，但是對于12例耐藥并且低HBV DNA載量的血清樣本,，PCR-CRISPR方法檢測陽性，而YMDD qPCR和測序方法卻沒有檢測出來,。因此基于CRISPR技術的PCR-CRISPR的檢測新方法對耐藥基因檢測具有顯著的優(yōu)越性,。

綜上，本研究建立了一種新型的,、高靈敏性和高特異性檢測HBV DNA和YMDD變異的PCR-CRISPR檢測新方法,，這種方法的廣泛應用將為HBV感染早期發(fā)現(xiàn)、HBV抗病毒治療評價和抗病毒藥物的耐藥監(jiān)測提供重要的指導意義,。

任鋒,，醫(yī)學博士，博士生導師,，2008.9～2010.10在美國加州大學洛杉磯分校做訪問學者,，師從我國著名肝病專家段鐘平教授。目前任首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院/北京市肝病研究所研究員,、教授,，肝衰竭課題組PI。入選北京市優(yōu)秀人才,，北京市十百千衛(wèi)生人才“百”層次人才，北京衛(wèi)生系統(tǒng)技術人才學科骨干,。目前主持國家“13.5”（2項）,，國家自然科學基金面上項目（2項）、北京市自然科學基金（面上1項,，重點1項）,、北京市科委臨床特色研究（首特2項，首診專項1項）,、首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項重點攻關項目等十余項課題,，參加國家 “12.5”,、“11.5”等重大專項以及973等科研項目研究。以第一作者和通訊作者發(fā)表科研論文20余篇,，分別在《Hepatology》,、《Cell death & Disease》、《Journal of Viral Hepatitis》,、《PLoS One》等重要國際學術期刊上,，累計影響因子達80余分。獲得2017年度北京市科技獎（三等獎）和2017年度中華醫(yī)學會科技獎（三等獎）,。申請CRISPR技術相關研發(fā)國家發(fā)明專利2項,。目前研究圍繞著HBV感染引起的肝衰竭肝損傷的基礎和臨床研究方面以及基于CRISPR技術研發(fā)傳染病病毒快速檢測方面開展系列研究。