近期,，首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院任鋒教授科研團隊在國際期刊《Emerging Microbes & Infections》（IF=13.2）發(fā)表了題為“CRISPR/Cas13a-Assisted Accurate and Portable Hepatitis D Virus RNA Detection”的學術論文,，該團隊利用CRISPR/Cas13a檢測新技術，聯(lián)合等溫擴增技術（RAA）,，建立了基于RT-PCR/RT-RAA-CRISPR/ Cas13a的HDV RNA快速,、便攜檢測方法。該方法為監(jiān)測HDV感染的發(fā)生發(fā)展和評價治療效果提供了新的手段,。首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院博士研究生田原,、范子豪和張向穎副教授為本研究的共同第一作者，任鋒教授和軍事醫(yī)學研究院李浩教授為共同通訊作者,。

HDV是一種單股環(huán)形負鏈RNA病毒,，由HBsAg外殼和HDV核心顆粒組成，核心顆粒包含1672~1697 個堿基,。HDV是缺陷病毒,，需要借助HBV來完成其生命周期。在全球普通人群中HDV的總患病率約為0.80%,，在HBsAg攜帶者中HDV總患病率約為13.02%,，相當于全球約有4800-6000萬的HDV感染者。與其他型肝炎病毒感染比較,，HDV感染進展速度更快，約70%丁型肝炎患者于5-10年內(nèi)發(fā)展為肝硬化,，15%的患者僅需1-2年即可進展為肝硬化,。HDV/HBV合并感染者發(fā)生肝硬化和肝癌的風險較HBV單獨感染者高。因此,，本研究旨在建立一種精準便攜的HDV核酸檢測方法,，為HDV感染的盡早發(fā)現(xiàn)和治療提供幫助。

成簇規(guī)律間隔短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR相關系統(tǒng)（Cas）作為一種新型的核酸檢測技術,，因其具有高靈敏度和高特異性的獨特特性,，在過去的十年中受到了廣泛的關注并取得了很大的進展。CRISPR新技術被《Nature》認為可能是2022年7大“顛覆性”技術之一,。2017年《Science》報道了美國麻省理工學院張峰團隊首次將CRISPR-Cas13a檢測技術與重組酶聚合酶擴增（RPA/RAA）技術相結(jié)合,，建立新的核酸檢測技術SHERLOCK，實現(xiàn)單拷貝、高特異性核酸檢測方法,。此外,，CRISPR系統(tǒng)可利用側(cè)流試紙條快速、便攜的特點,，無需專業(yè)人員即可實現(xiàn)病原核酸的高靈敏度,、高特異性檢測。目前針對HDV檢測的試紙條主要依靠丁型肝炎病毒抗原抗體檢測,，而針對HDV RNA的即時檢測（POCT）檢測仍是空白領域,。CRISPR/Cas檢測——新興的核酸分子診斷技術已經(jīng)滿足了試紙條的敏感性、特異性和低成本的要求,，成為POCT的發(fā)展趨勢,。因此，側(cè)流試紙條結(jié)合CRISPR/Cas技術可為HDV RNA的快速檢測提供新的平臺,。

圖1：基于CRISPR-Cas13a的HDV RNA檢測原理示意圖

本研究利用CRISPR/Cas13a檢測新技術聯(lián)合RT-PCR/RT-RAA技術,，建立了RT-PCR/RT-RAA-CRISPR/Cas13a的HDV RNA的檢測方法。通過對大約500條HDV基因序列比對,，確定保守區(qū)序列,，并基于此序列設計和篩選出了最佳的RT-RAA引物、RT-PCR引物和crRNA,，并對此申請了相關國家專利（202311065728.8）,。

圖2：RT-RAA引物、RT-PCR引物和crRNA的設計和篩選

其次,，該方法可有效鑒定HDV RNA陽性質(zhì)粒和陽性臨床樣本,，且靈敏度為1拷貝/μL。同時,，也對整個檢測反應進程進行了相應的條件優(yōu)化,。因此，該研究成功有效地建立了一個HDV RNA的CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng),。

圖3：使用合成HDV RNA陽性質(zhì)粒評估RT-PCR-CRISPR和RT-RAA-CRISPR方法,。

本研究將基于RT-RAA-CRISPR/ Cas13a系統(tǒng)與膠體金試紙結(jié)合使用，實現(xiàn)了快速,、便攜地HDV RNA檢測,。并通過HDV RNA陽性質(zhì)粒和陽性臨床樣本分別對該方法進行了驗證。

圖4：HDV RNA的RT-RAA-CRISPR橫向側(cè)流試紙條檢測

為進一步評估CRISPR/Cas13a檢測方法的有效性,，選取144例IgG陽性的臨床血漿樣本進行驗證,。分別用RT-qPCR、RT-ddPCR,、RT-PCR-CRISPR熒光法和RT-RAA-CRISPR試紙條法進行比較,。其中,，RT-PCR-CRISPR熒光法的檢測率（81.9%）和RT-RAA-CRISPR試紙條法的檢出率（72.2%）均高于RT-qPCR（66.7%）和RT-ddPCR（76.4%）。

圖5：IgG陽性患者的HDV RNA檢測

綜上所述,，我們開發(fā)了新的RT-PCR-CRISPR熒光法和RT-RAA-CRISPR試紙條檢測HDV RNA的方法,，該方法不僅靈敏度高、特異性強,，而且耗時少,、操作方便。這項研究為監(jiān)測疾病的發(fā)生和發(fā)展以及評估治療效果提供了一個強有力的工具,。